Roberta Pesce: [00:00:00] Benvenuti al nostro primo discorso del terzo giorno, dove impareremo di più sul Biorepository AFM dei Centri per il controllo e la prevenzione delle malattie, seguito da una tavola rotonda moderata sulla ricerca AFM con sessioni di domande e risposte.

[00:00:18] Si uniscono a noi Eileen Yee, epidemiologa medica della mielite flaccida acuta, divisione di malattie virali del team nazionale per la poliomielite presso il Centro nazionale per l'immunizzazione e i centri per le malattie respiratorie del CDC, la dott.ssa Amy Rosenfeld, assistente professore del Dipartimento di Microbiologia e Immunologia della Columbia University, Dr. Nischay Mishra, Assistente Professore presso il Center for Infection and Immunity della Columbia University, e Dr. Janell Routh, Medical Officer, Lead, AFM and Domestic Poliovirus Team presso CDC.

[00:00:47] Questo panel sarà guidato dal Dr. Carlos Pardo, Professore di Neurologia e Patologia Divisione di Neuroimmunologia e Malattie Neuroinfettive e Direttore del Johns Hopkins Myelitis and Myelopathy Center presso la Johns Hopkins University School of Medicine di Baltimora, che inizierà la conversazione fornendo una breve panoramica sulla ricerca AFM e sottolineando l'importanza di questi studi di ricerca. Dottor Pardo, salve. A voi.

Dott. Carlos Pardo: [00:01:13] Grazie mille. Grazie mille, Roberta. È bello essere qui stamattina. Grazie a tutti per essere presenti a questa tavola rotonda sulla mielite flaccida acuta. Come sapete, la mielite flaccida acuta è stata una sfida importante per molti pazienti e famiglie dal 2012, ma molto probabilmente è stata una sfida per altre famiglie anche prima perché è molto probabile che la mielite flaccida acuta sia uno di quei disturbi che sono stati spesso ignorati , diagnosticata erroneamente o fondamentalmente non molto ben riconosciuta prima del 2012, quando la mielite flaccida acuta è emersa come una delle principali malattie che colpiscono i bambini negli Stati Uniti.

[00:02:05] La mielite flaccida acuta è stata riconosciuta in tutto il mondo come un problema che colpisce prevalentemente i bambini e produce una quantità piuttosto significativa di disabilità neurologica e una quantità molto importante di stress, non solo per i pazienti, ma anche per le famiglie . La mielite flaccida acuta è una malattia molto difficile. Sembra essere una malattia infettiva mediata. Molti membri delle famiglie sono affetti da problemi respiratori e nonostante molti membri della famiglia o del nucleo familiare siano affetti da problemi respiratori, solo i bambini piccoli sono affetti da mielite flaccida acuta.

[00:02:50] E anche solo pochi, solo uno dei bambini della famiglia può essere colpito da mielite flaccida acuta. Prossimo. Quindi, quello che capiamo della mielite flaccida acuta è che è un problema in evoluzione molto aggressivo e molto acuto. E puoi vedere in questa diapositiva che si basa sulla caratterizzazione prodotta dal CDC nella popolazione di pazienti valutata durante l'epidemia del 2018, che la maggior parte dei pazienti, il 94% dei pazienti ha una malattia precedente caratterizzata principalmente da febbre e malattie respiratorie. Ma nel corso di poche ore, fino a 48 ore, molti bambini sviluppano effettivamente un problema neurologico molto aggressivo, in particolare perché i pazienti rimangono paralizzati e i pazienti, molti di loro, quasi il 50% di loro, richiedono effettivamente la gestione dell'unità di terapia intensiva perché i pazienti sviluppare insufficienza respiratoria.

[00:03:54] E, sfortunatamente, una popolazione molto ampia di pazienti affetti da mielite flaccida acuta presenta una significativa disabilità neurologica. E quasi un terzo, un quarto di loro, in realtà, sono rimasti con paralisi sia agli arti superiori che inferiori. E quasi il 40% dei pazienti presenta una significativa compromissione della mobilità, in particolare degli arti superiori.

[00:04:20] Quindi, questo è un problema molto importante a cui potremmo dover prestare attenzione perché sta producendo una quantità significativa di disabilità e problemi neurologici a lungo termine. Se diamo un'occhiata alla diapositiva successiva, quello che capiamo è che davanti a noi c'è una strada molto lunga per capire e prendersi cura della mielite flaccida acuta.

[00:04:47] In tutto il paese, ci sono state diverse iniziative incentrate sul miglioramento della diagnosi, sul miglioramento della sorveglianza. C'è stata una campagna molto importante per la formazione di pediatri clinici, neurologi per comprendere la mielite flaccida acuta. E c'è stato uno sforzo molto importante, uno sforzo incentrato sul sostegno alle famiglie perché i problemi a lungo termine, i problemi neurologici che le famiglie stanno vivendo con questi pazienti sono travolgenti e ovviamente il sostegno familiare è fondamentale.

[00:05:25] Tuttavia, una cosa estremamente importante è la ricerca, è ciò che stiamo facendo per comprendere la mielite flaccida acuta. Ed ecco, dobbiamo delineare i diversi elementi che sono in quella lunga lista per comprendere la mielite flaccida acuta. Il primo è forse capire il ruolo delle malattie virali e di virus specifici come gli enterovirus come agenti causali di questa malattia. Dobbiamo capire il sistema immunitario. Dobbiamo capire in che modo il sistema immunitario sta partecipando come meccanismo difensivo e difensivo nel corpo o sta addirittura attivando un meccanismo che può produrre qualche danno.

[00:06:11] Dobbiamo migliorare la diagnosi e dobbiamo capire meglio in che modo i diversi fattori sono associati alla prognosi e all'esito. E un aspetto più importante è migliorare la diagnosi, migliorare il trattamento e la prevenzione per evitare queste malattie difficili. Prossimo. Ci sono diversi sforzi a livello nazionale e tutti gli sforzi sono legati alla comprensione della malattia attraverso la raccolta di dati clinici, la raccolta di campioni biologici e una migliore comprensione della malattia.

[00:06:44] Uno di questi sforzi, poi, è lo studio lanciato dal National Institute of Health, il Natural History Study of acute flaccid mielite, coordinato dal Dr. David Kimberlin presso l'Università dell'Alabama a Birmingham. L'Istituto Superiore di Sanità sostanzialmente sta finanziando questo studio prospettico per definire la storia naturale, i fattori di rischio e comprendere meglio il meccanismo patogenetico della malattia.

[00:07:11] Il prossimo. Quindi, quando parliamo di questi studi, parliamo degli studi che coinvolgono molte persone in tutto il paese. E, al momento, ci sono quasi 35 centri in tutto il paese coinvolti nel NIH Natural History Study. È, ancora una volta, raccogliere campioni biologici e incentrato sulla comprensione della malattia. Prossimo.

[00:07:35] E una cosa che stiamo facendo è uno studio caso controllo. Lo studio caso controllo è l'unico modo per comprendere i fattori di rischio associati a una malattia. In questo modo, c'è enfasi nell'includere pazienti con mielite flaccida acuta che hanno sviluppato la malattia in cui siamo in grado di caratterizzare le caratteristiche cliniche e siamo in grado di acquisire anche campioni biologici. Prossimo.

[00:08:02] Potremmo aver bisogno di ottenere un gruppo di controllo, perché il gruppo di controllo è quello che aiuterà a capire come se ciò che stiamo vedendo nella nostra popolazione di pazienti sia associato davvero come fattore causale o sia non necessariamente un fattore causale. E stiamo fondamentalmente coinvolgendo i parenti o i residenti della famiglia e il bambino che è stato colpito da mielite flaccida acuta come partecipanti come controllo di gruppo. E ancora, è estremamente importante acquisire questo gruppo di controllo, perché è l'unico modo per acquisire anche campioni biologici che possono essere utilizzati per facilitare una migliore comprensione di tutti quei fattori immunologici e virologici. Prossimo.

[00:08:52] Ci sono altri studi come lo studio genetico condotto dalla dottoressa Priya Duggal, professore di epidemiologia presso la John Hopkins School of Public Health. E molte famiglie negli ultimi otto anni hanno partecipato a questo studio che fondamentalmente è diretto a capire se ci sono fattori genetici che stanno influenzando la presenza di mielite flaccida acuta. E in questo momento, ci sono più di 150 pazienti e famiglie che sono stati arruolati in questo studio.

[00:09:22] Ma la cosa più importante è che dobbiamo venire e fondamentalmente continuare il nostro sforzo per raccogliere questi dati per comprendere la mielite flaccida acuta. E lo sforzo del CDC è molto importante e complementare allo sforzo che il NIH sta facendo in questo momento. Quindi, passerò il mio microfono alla dottoressa Eileen Yee, che è al CDC e ci aiuterà a capire cosa sta facendo il CDC per partecipare a queste raccolte biorepository di dati clinici e campioni biologici. Eileen, grazie mille per essere qui presente stamattina.

Dott.ssa Eileen Yee: [00:10:03] Grazie mille, dottor Pardo, per l'introduzione. E proprio ora, vorrei solo ripassare un po' il CDC AFM Biorepository. E ancora, voglio solo ringraziare tanto Rebecca, GG, Roberta, il dottor Pardo e SRNA per avermi invitato a questa tavola rotonda di ricerca oggi. E per condividere con voi come CDC è coinvolto in questa iniziativa di ricerca. Prossima diapositiva.

[00:10:29] Come affermato dal Dr. Pardo, ci sono molte domande senza risposta sull'AFM. E alcuni di questi sono stati discussi anche nel febbraio 2020 in un seminario con l'Istituto nazionale per le malattie infettive allergiche.

[00:10:41] E c'era un ottimo documento riassunto da Lerner e altri, che elencava alcune delle domande e le cose che stiamo facendo al CDC e anche intorno alla comunità di ricerca. E tuttavia, come ha affermato il dottor Pardo, per rispondere ad alcune di queste domande, è necessario testare e analizzare campioni clinici di pazienti con AFM. Pertanto, è stato rapidamente riconosciuto che abbiamo bisogno di ottenere e raccogliere questi campioni biologici in modo prospettico da pazienti con AFM in questo momento. E così, prossima diapositiva.

[00:11:15] Quindi, in generale, un biorepository è una raccolta di campioni biologici, come sangue, feci, liquido cerebrospinale e altri campioni clinici, conservati in una struttura in grado di proteggere, manipolare e conservare materiali biologici per uso futuro.

[00:11:29] Prossima diapositiva. Alla fine del 2019, CDC ha assegnato un contratto alla General Dynamics Information Technology e alla McKing Consulting Corporation per sviluppare e mantenere un AFM Biorepository. McKing aveva già progettato e implementato con successo un altro biorepository per CDC incentrato sulla SLA. E così, sono stati un collega gradito per assistere il CDC in questa impresa.

[00:11:56] L'AFM Biorepository... la diapositiva prima. Grazie. L'obiettivo è costruire una banca di campioni abbinati a dati epidemiologici e clinici che possano essere utilizzati dai ricercatori per determinare la causa e i fattori di rischio dell'AFM, nonché migliori opzioni di trattamento per le persone affette da questa condizione.

[00:12:16] E questo è stato ancora una volta, come ha detto il Dr. Pardo, è stato progettato per allinearsi il più possibile con il Biorepository di storia naturale NIH e AFM ed essere solo un progetto di ricerca complementare. Puoi tenere questa diapositiva.

[00:12:31] Questi sono i criteri di inclusione ed esclusione. I criteri di inclusione sono tutti i pazienti di età pari o superiore a tre mesi. Quindi, includiamo gli adulti con insorgenza di debolezza degli arti che coinvolge una o più estremità suggestive di AFM nei 30 giorni precedenti e per i quali un medico ha fornito una diagnosi di sospetta AFM ai partecipanti e ai loro familiari e che accettano di utilizzare il loro campioni per uso futuro. Un'esclusione è ovviamente chiunque sia all'ospedale NIH e, o con una condizione nota diversa dall'AFM che causa la loro debolezza agli arti, o se sono un reparto dello stato o un prigioniero e, o rifiutano di acconsentire alla partecipazione. Prossima diapositiva.

[00:13:13] I partecipanti idonei possono essere identificati attraverso tre meccanismi. Possono effettivamente essere identificati tramite il medico o il coordinatore del sito presso uno degli ospedali partner, quando un paziente viene identificato e ricoverato in ospedale. E in secondo luogo, possono essere identificati attraverso i dipartimenti sanitari statali o locali quando un sospetto caso di AFM viene segnalato al CDC. Infine, i pazienti e le loro famiglie possono identificarsi direttamente e contattare direttamente l'AFM Biorepository per partecipare. In quei casi, tuttavia, ai partecipanti verrà chiesto di chiedere al proprio medico di verificare che si tratti di un sospetto caso di AFM. Prossima diapositiva.

[00:13:54] Nel complesso, i pazienti vengono identificati e quindi i materiali informativi vengono condivisi. Quindi l'ospedale o il medico, o anche il dipartimento sanitario, contatteranno direttamente McKing per informarli del potenziale partecipante. Se il paziente è disposto a partecipare, l'iscrizione al consenso informato sarà condotta e coordinata da McKing.

[00:14:12] E se un kit di raccolta non è già disponibile, allora un kit di raccolta verrebbe spedito all'ospedale oa casa del paziente, se è stato dimesso. La raccolta del campione acuto o convalescente verrà effettuata e spedita durante la notte a Fisher BioServices, dove i campioni vengono quindi ulteriormente elaborati per la conservazione a lungo termine. Prossima diapositiva.

[00:14:34] I campioni acuti vengono raccolti in ospedale da sette a nove giorni dopo l'insorgenza di debolezza degli arti. E questo includerebbe un campione di sangue, CSF, feci o un tampone NP/OP, e campioni di convalescenti sarebbero raccolti a casa di un paziente o in un'area che è più conveniente per loro attraverso un'agenzia nazionale di flebotomia, da quattro a otto settimane dopo. E stanno solo raccogliendo campioni di sangue. E il piano è quello di unire tutti questi campioni provenienti dai biorepository NIH e CDC in un biorepository comune. Prossima diapositiva.

[00:15:13] Attualmente lo studio sta iscrivendo attivamente i partecipanti tutto l'anno dall'ottobre del 2020. E continueranno a farlo fino alla fine del 2022. Alcuni punti salienti, rapidamente, è che c'è stato un coinvolgimento attivo con le chiavi ospedali che collaborano con McKing. Quindi, questi ospedali sono pronti e pronti a segnalare qualsiasi caso a McKing e raccogliere campioni. Quindi, c'è stata una rete ospedaliera che è stata istituita da McKing per ricordare loro regolarmente l'AFM Biorepository.

[00:15:41] E infine, c'è stata una grande campagna per aumentare la consapevolezza di questo biorepository, attraverso molti luoghi diversi come questo e le informazioni possono essere facilmente accessibili attraverso il sito web di ricerca CDC e SRNA, e vengono inviate comunicazioni regolari ai membri di molteplici associazioni professionali, mediche e neurologiche. Ultima diapositiva, per favore.

[00:16:04] Per ulteriori informazioni, puoi visitare il sito Web CDC AFM e puoi trovare collegamenti a una tabella che descrive sia l'AFM Biorepository che lo studio di storia naturale NIH. E puoi anche contattare McKing direttamente tramite la loro hotline e l'indirizzo e-mail per porre qualsiasi domanda o per informarli di eventuali potenziali partecipanti con sospetta AFM.

[00:16:24] Infine, voglio solo riconoscere il lavoro svolto da McKing e, ai pazienti che hanno già contribuito e contribuiranno a questi biorepository, vi ringraziamo davvero. Sappiamo che potresti non essere direttamente beneficiato in questo momento, partecipando allo studio, ma sappiamo che i tuoi contributi sono molto necessari e apprezzati dalla comunità AFM. Quindi, insieme possiamo rispondere a più di queste domande. Grazie. Torniamo a lei, dottor Pardo.

Dott. Carlos Pardo: [00:16:48] Grazie mille, Eileen. È bello sapere dello sforzo del CDC che per molti versi si sovrappone molto bene, perché anche il NIH e lo studio di storia naturale stanno facendo.

[00:17:03] Quindi, ci sono due membri della comunità di ricerca nel nostro pubblico qui e come presentatori. Vorrei sentire il dottor Nischay Mishra, che è alla Columbia University. È un ricercatore e anche uno scienziato molto dedicato a comprendere l'immunologia delle malattie infettive. Quindi, Nischay, stiamo raccogliendo campioni biologici. Siamo molto interessati alla diagnosi. Ti dispiace dare una breve visione come scienziato, cosa fai in laboratorio per capire l'AFM?

Dott. Nischay Mishra: [00:17:44] Grazie, Pardo, innanzitutto per aver invitato me e SRNA per una così buona iniziativa e grazie, Roberta, per avermi accompagnato attraverso l'intero processo di Hopin l'altro giorno. E così, ho preparato un paio di diapositive che condividerò con voi ragazzi così possiamo parlare di quello che ho fatto. Lavoro al Center for Infection and Immunity della Columbia University, noto come Lipkin Lab.

[00:18:07] Quindi, fondamentalmente, usiamo piastre molecolari, virologiche, sierologiche e immunologiche come analisi e conoscenze per costruire analisi diagnostiche e caratterizzare analisi genomiche. Non solo per una diagnostica in laboratorio, ci spingiamo oltre anche per i processi di approvazione che possono essere utili e disponibili per tutti.

Roberta Pesce: [00:18:30] Nischay, molto rapidamente, non credo che le tue diapositive siano condivise al momento.

Dott. Nischay Mishra: [00:18:34] Sto condividendo in questo momento. Sì.

Roberta Pesce: [00:18:36] Va bene. Perfetto. Grazie.

Dott. Nischay Mishra: [00:18:42] Ragazzi, riuscite a vedere il mio schermo?

Roberta Pesce: [00:18:47] Sì, possiamo.

[00:18:53] Sì, sembra perfetto. Grazie.

Dott. Nischay Mishra: [00:18:55] Sì. Quindi, riassumiamo il lavoro che abbiamo svolto. Quindi, nel 2019, abbiamo collaborato con CDC Respiratory Virus Group, il gruppo del Dr. Oberste, e poi, quella volta, stavamo cercando di indagare sull'associazione di EV-D68 direttamente o indirettamente con la mielite flaccida acuta. Quindi, per questo ho costruito un array che è un array di peptidi, che copre l'intera proteina del capside di tutti gli enterovirus, anche alcuni altri agenti patogeni sospettati all'epoca: virus del Nilo occidentale, malattia di Lyme, eccetera. E poi abbiamo prelevato il campione di CSF dai bambini AFM, e poi anche i controlli che abbiamo raccolto dalla Columbia University e altrove dalle altre malattie.

[00:19:36] Quindi, come funziona? Quindi, questo è un vetrino. Questo può contenere da 180 a 200,000 peptidi, i peptidi sono stampati sulla matrice di vetro. Usiamo il campione che conteneva l'anticorpo primario. Tutti i peptidi coprono l'intera proteina del capside con la sovrapposizione di 12 e 11 aminoacidi, quindi non abbiamo alcun artefatto o non perdiamo alcun sito di legame dell'epitopo. Ed è molto altamente sensibile.

[00:19:58] Il volume del campione utilizzato è inferiore a cinque microlitri. Quindi, può essere come anche il campione di volume più piccolo disponibile, possiamo farlo. Abbiamo utilizzato il campione di siero e CSF del paziente e del controllo AFM. Quindi, fondamentalmente, carichiamo i campioni durante la notte, incubando il peptide, che può contenere il sito di legame dell'epitopo, si lega agli anticorpi presenti nel campione. La seconda mattina lo laviamo e poi usiamo l'anticorpo secondario che potrebbe avere etichette diverse. Potrebbe essere Cy3, Alexa Fluor e Cy5, e possiamo eseguire insieme un rilevamento di almeno due anticorpi.

[00:20:30] Quindi prendiamo il disegno virtuale, che è le coordinate di tutti i 180,000, in totale 3 milioni di peptidi stampati sulla matrice di vetro, e ci sovrapponiamo. E poi, dopo che arriva un segnale, cambiamo l'unità arbitraria e scopriamo se questo peptide è positivo o meno.

[00:20:45] Successivamente, tutti i peptidi continui non vengono stampati insieme. Quindi, per evitare qualsiasi tipo di artefatto, sono tutti posizionati in modo casuale. E poi eseguiamo l'analisi di regressione e l'unione dei dati utilizzando alcuni strumenti di modellazione. E poi identifichiamo qual è la sequenza peptidica sovrapposta, che potrebbe essere l'epitopo (che) è reattivo a quel campione.

[00:21:04] Utilizzando l'approccio del campionatore, abbiamo identificato nuovamente il motivo dell'enterovirus di consenso e abbiamo anche identificato uno specifico peptide EV-D68 presente solo nel paziente AFM. Vedi il pannello inferiore. E questo l'abbiamo pubblicato nel 2019 con i nostri colleghi del CDC.

[00:21:23] Ecco, puoi vedere il campione di CSF. Sono tutti peptidi di enterovirus, che è il motivo conservato, perché lo sono, condividono molta omologia. E prevediamo sempre, ad esempio, una delle regioni, ad esempio, come la sierodiagnostica dell'enterovirus sia difficile perché sono strettamente associate e possono reagire in modo incrociato tra loro o possono anche potenziare gli anticorpi l'uno per l'altro. Abbiamo creato il peptide ELISA basato anche sul peptide EV-D68 e poi abbiamo testato il campione anche con ELISA, e abbiamo potuto trovare un'ottima correlazione con i dati dell'array di peptidi, quindi questo ci dice che questo può essere usato per la diagnostica, come siero diagnostico e questo peptide è sensibile e specifico per il rilevamento di EV-D68 nei pazienti con AFM. Sulla base di quell'ideologia, di recente, tipo, l'anno scorso o prima, ho collaborato con Amy Rosenfeld. Anche lei partecipa a questa chiamata e volevamo espandere questo array di peptidi.

[00:22:17] Quindi, ho ampliato l'array di peptidi con il miglioramento della tecnologia. Posso stampare ora 390,000 peptidi per sub microarray, per un totale di 6 milioni di peptidi. Ci siamo espansi dal capside alle poliproteine ​​complete. Inoltre, abbiamo aggiunto i rinovirus perché sono strettamente associati a EV-D68. E avevamo anche un peptide casuale, uno scramble per la raccolta di sfondo.

[00:22:39] Quindi, questo array di peptidi è in uso, ho ricevuto un campione di recente, come l'anno scorso, da Kevin Messacar e Ben Greenberg dal Texas. Abbiamo usato un paio dei loro esperimenti l'anno scorso. Non è stato molto produttivo per gli esperimenti EV-D68 perché principalmente riguardava la ricerca COVID, ma abbiamo fatto alcuni esperimenti.

[00:22:57] Abbiamo identificato un peptide aggiuntivo, che analizzerò di più e poi pubblicherò o condividerò con tutti voi nel prossimo futuro. Farò una pausa per questo, come, in questo momento, cosa sono, cos'altro stiamo cercando di fare. Quindi, poiché abbiamo già identificato questi peptidi che sono EV-D68, ho collaborato con Amy, e quindi volevamo vedere l'utilità di questo peptide, come possiamo usare questo peptide per una diagnostica rapida.

[00:23:27] Quindi, ci abbiamo pensato, perché a volte è molto difficile per il paziente e il medico sapere se un paziente è positivo per l'EV-D68 nella fase acuta respiratoria. Quindi, volevamo fare un'analisi acuta. Lo stiamo osservando e come un peptide per aumentare gli anticorpi.

[00:23:45] Quelli sarebbero specifici per il rilevamento dell'enterovirus D68. E abbiamo fatto alcuni esperimenti con il modello dei topi. Abbiamo progettato alcuni peptidi e abbiamo fatto alcuni ELISA, quelli sembrano promettenti. Quindi, andremo avanti per il test di riduzione della cattura dell'antigene, su cui stiamo lavorando. E poi, dopo, cercheremo anche altri peptidi di enterovirus che siano specifici.

[00:24:06] Stiamo cercando di espandere questo test basato sull'antigene o come un test Luminex, che possiamo rilevare rapidamente, e non solo rilevare, possiamo differenziare quale enterovirus è entro un paio d'ore. Quindi, un paziente che viene rilevato con EV-D68 può essere monitorato al momento della stessa malattia respiratoria, se sviluppa qualsiasi tipo di sintomi di mielite flaccida acuta nelle prossime settimane o qualcosa del genere, e il medico e i ricercatori possono essere più specifici sul trattamento così come la diagnostica. Grazie.

Dott. Carlos Pardo: [00:24:38] Grazie, Nischay. Questo è molto utile. E, come il pubblico ha potuto vedere, c'è stato uno sforzo molto importante da parte di scienziati come Nischay per comprendere l'immunologia della mielite flaccida acuta. E Nischay ha menzionato gli enterovirus, ma non meglio della dottoressa Amy Rosenfeld per spiegarci perché siamo preoccupati per i virus e in particolare per gli enterovirus come potenziale fattore associato all'AFM e, per il pubblico, ci sono molti scienziati - immunologi, neurofisiologi, ma lo so, gli scienziati molto importanti qui che svolgono un ruolo fondamentale per la comprensione delle malattie infettive sono la virologia.

[00:25:25] Allora, Amy, ti spiace spiegarci perché siamo preoccupati per l'enterovirus nell'AFM e qual è il lavoro che fai per comprendere la malattia?

Dott.ssa Amy Rosenfeld: [00:25:34] Grazie, Carlos e SRNA, per avermi invitato a parlare con voi oggi. Quindi, sono uno scienziato di base. Sono un virologo di base tradizionale e fondamentale, e ho assunto la mia posizione, un'estensione del lavoro svolto da Vincent Racaniello e altri che hanno studiato la poliomielite. E la poliomielite è l'agente eziologico tradizionale che associamo alla mielite flaccida acuta o alla poliomielite. E in realtà, mielite flaccida acuta è un termine che è stato usato per andare sul campo e guardare i bambini e sondare la paralisi dovuta all'infezione da poliovirus. E ora riconosciamo che l'intera famiglia di enterovirus può portare a AFM o mielite flaccida acuta, sono patogeni neuropatici.

[00:26:29] E quindi non sono solo interessato a EV-D68, che è l'agente più noto di AFM oggi. Ma sono interessato all'intera famiglia di virus che si associano o la cui infezione si associa all'AFM. E questi includono virus correlati come coxsackie A16 e enterovirus 71. E facciamo un intero pannello di virus diversi.

[00:26:57] Stiamo tentando di creare modelli animali per capire come l'infezione primaria si diffonde ed entra nel sistema nervoso centrale e causa la morte neuronale, l'immunologia e qual è il ruolo del sistema immunitario nell'ospite in quello sviluppo processi.

[00:27:16] Inoltre, siamo anche interessati a capire come il virus viene trasmesso, diffuso e capire e cercare di capire dove possiamo progettare interventi. Perché, una volta individuata la paralisi, è davvero troppo tardi per progettare gli interventi e vanno fatti molto prima.

[00:27:40] Quindi, quando il bambino arriva con un'infezione respiratoria o qualcosa del genere, di solito, sfortunatamente, molti di questi sintomi si sovrappongono ad altri agenti patogeni respiratori. E quindi, siamo interessati al lavoro con Nischay che siamo stati in grado di progettare un test che distinguerà e discriminerà tra questi agenti patogeni.

[00:28:04] E la famiglia degli enterovirus ha molta conservazione. E tradizionalmente pensavamo che, se avevi la presenza di anticorpi contro il virus, potessimo rilevarli, era usato come strumento per fare una storia di quali malattie o virus a cui sei stato esposto. E oggi sappiamo che non è così facile come pensavamo. C'è molta somiglianza tra questi virus e, quindi, molti degli anticorpi che vengono suscitati durante l'infezione virale riconoscono effettivamente l'intero pannello di virus.

[00:28:39] E quindi stiamo cercando di capire come funziona e se c'è o meno qualcosa in ciò a cui sei stato esposto o nell'assenza di sviluppo di anticorpi che ti sottopone maggiormente a queste devastanti conseguenze secondarie del infezione virale. E sono felice di rispondere a qualsiasi domanda e aiutarti a capire cosa significa essere uno scienziato di base in virologia o solo in generale.

Dott. Carlos Pardo: [00:29:11] Grazie, Amy. È molto utile. Roberta, se riusciamo a portare l'intero gruppo alla tavola rotonda e vorrei chiedere alla dottoressa Janell Routh del CDC, che è il leader nello sforzo di sorveglianza per la mielite flaccida acuta. Janell, ti dispiace darci solo un aggiornamento su ciò che stiamo vedendo sull'AFM e sulla circolazione degli enterovirus negli ultimi mesi, nel contesto dell'attuale pandemia con COVID-19? Dicci solo cosa sta succedendo e cosa ci aspettiamo in futuro.

Dott.ssa Janell Routh: [00:29:55] Carlos, grazie mille. E ancora, volevo ringraziare SRNA e tutti per aver ospitato questo panel oggi. Sai, è stato molto interessante monitorare la sorveglianza per l'AFM negli ultimi anni. Penso che, come tutti sanno, il nostro ultimo forte aumento di casi di AFM sia avvenuto nel 2018.

[00:30:18] Sappiamo di aver visto un aumento dei casi dal 2014, proprio quando l'AFM è emersa sulla scena nazionale. E abbiamo avuto una periodicità ogni due anni per quell'aumento dei casi di AFM, nel 2014, 2016 e poi nel 2018. Quindi, stavamo davvero anticipando un altro aumento dei casi nel 2020. Tuttavia, ciò ha coinciso con la pandemia di COVID e, interessante, penso che alcuni degli sforzi per prevenire la diffusione di COVID abbiano effettivamente impedito la diffusione di altri virus respiratori, incluso l'enterovirus D68, come menzionato sia da Amy che da Nischay.

[00:31:01] E quindi non abbiamo visto un aumento dei casi di AFM nel 2020. Quindi, penso che stessimo tutti pensando a cosa sarebbe successo di nuovo nel 2021. Ma come nel 2020, non abbiamo visto un forte aumento nei casi in AFM, fortunatamente anche questo autunno.

[00:31:22] Sappiamo che generalmente l'AFM tende a essere visto alla fine dell'estate, all'inizio dei mesi autunnali di settembre e ottobre. Ma, finora, quest'anno non abbiamo registrato un aumento dei casi. In concomitanza con ciò, non abbiamo nemmeno visto un aumento della circolazione dell'enterovirus D68. Ancora una volta, come ha detto Amy, pensiamo che sia la causa principale dell'AFM e questi anni di punta sono gli anni in cui vediamo un aumento dell'AFM.

[00:31:53] Quindi, né un aumento dell'AFM né un aumento della circolazione EV-D68, almeno finora quest'anno. Resta da vedere cosa sta succedendo. So che stiamo assistendo a un aumento della circolazione complessiva di enterovirus e rinovirus. Ma finora, non quel particolare virus che tendiamo ad associare all'AFM in questi anni di punta.

[00:32:17] Continuiamo a essere vigili. Abbiamo una rete di coordinatori delle malattie prevenibili da vaccino in ogni stato del paese in cui i medici segnalano un caso sospetto di AFM. Siamo costantemente in contatto con loro e monitoriamo la situazione. Quindi, tenendo le dita incrociate, non vediamo un aumento mentre ci spostiamo nel tardo autunno ora.

[00:32:41] E poi tutti gli occhi saranno puntati sul 2022. Ancora una volta, è molto difficile prevedere cosa potremmo vedere nel 2022, ma, sai, uno degli obiettivi principali del nostro team AFM qui al CDC è aumentare sensibilizzare e promuovere l'educazione in modo che i medici di tutto il paese capiscano cos'è l'AFM e possano essere vigili per i sintomi. Quindi, continueremo a farlo nel 2022 per assicurarci di rilevare qualsiasi caso sospetto o aumentare i casi. A voi.

Dott. Carlos Pardo: [00:33:16] Grazie, Janell. È molto utile. Quindi, ho una domanda prima per Amy e poi per Nischay. Quindi, Amy, in ambito clinico, raccogliamo tamponi nasali, solo per dimostrare che c'è o non c'è virus. In un ambiente clinico, raccogliamo campioni di sangue per vedere se ci sono marcatori che ci aiutano a identificare l'AFM. In qualità di ricercatore, ti dispiace spiegare al pubblico come li usi per cercare di identificare il virus e quanto sono utili quei campioni e, e, e, in particolare, per sottolineare perché quei campioni sono fondamentalmente estremamente importanti per il futuro della comprensione dell'AFM?

Dott.ssa Amy Rosenfeld: [00:34:06] Quindi, lo siamo, usiamo questi campioni per migliorare la nostra modellazione, prima di tutto. Quindi, è molto, generalmente questi campioni sono molto, è molto difficile coltivare virus infettivi da loro. Ma li usiamo per determinare, per identificare i genomi o l'RNA che è presente lì. E questo ci dà qualche indicazione su quale agente patogeno è presente.

[00:34:35] E poi proviamo a modellarlo usando gli animali in laboratorio per imitare la malattia umana. E usiamo questi campioni per tracciare per assicurarci che i nostri modelli siano in linea con ciò che pensiamo sia effettivamente la malattia. E poi capire come funziona il meccanicismo, fare studi meccanicistici per capire cosa rende l'AFM o cosa causa la diffusione del virus dalle vie respiratorie al sistema nervoso centrale.

[00:35:01] E ci piace molto che i campioni comprendano anche l'evoluzione del virus, quindi se il virus è cambiato o meno nel tempo e se questi cambiamenti si associano o meno a malattie più o meno gravi. E così, questo ha funzionato davvero bene nel pubblico in una certa misura nella discussione sulle infezioni da SARS-CoV-2, sulla resistenza ai vaccini, sul potenziamento o sulla fuga e su quelle che vediamo come varianti.

[00:35:31] Quindi, che tu sia d'accordo o meno, siamo tutti d'accordo sull'interpretazione dei dati, possiamo vedere che il virus è cambiato da quando è stato isolato per la prima volta fino ad oggi e se questi cambiamenti causano o meno un fenotipo i cambiamenti. Ed è più o meno per questo che usiamo questi campioni, da qualsiasi virus. Quindi, EV-D68, entero 71, coxsackie A16, qualsiasi cosa vogliamo monitorare se questi cambiamenti stanno davvero aiutando a capire se anche le patologie stanno cambiando o meno.

Dott. Carlos Pardo: [00:36:08] Grazie, Amy. Allora, Nischay, nei tuoi esperimenti parlavi di immunologia per il rilevamento degli enterovirus. Stavi parlando di peptidi e di tutti quegli aspetti della tua ricerca immunologica. Ma puoi spiegarci il valore di una comprensione acuta del sistema immunitario e ciò che tu o Eileen avete menzionato nella sua presentazione, il siero di convalescenza? Quindi, qual è il valore quando chiediamo alle famiglie di ottenere, permetterci di ottenere campioni biologici in modo acuto e anche poche settimane dopo, o anche mesi dopo? Ti dispiace spiegarlo brevemente?

Dott. Nischay Mishra: [00:36:53] Certo, dottor Pardo, tipo, quindi ci sono un paio di cose. Ad esempio, per lo più questi bambini sono in tenera età nel loro ciclo di vita e quindi è ancora importante sapere se sono esposti a questo virus o a uno di quei virus, EV-D68 o qualsiasi enterovirus, è la prima infezione della loro vita ? Inoltre, è importante saperlo perché, ne abbiamo parlato più volte, anche di ADE, potenziamento dipendente da anticorpi.

[00:37:20] Quindi dobbiamo sapere quale virus, come l'enterovirus D68, il primo enterovirus che viene esposto ai bambini che porta all'AFM o ci sono state precedenti infezioni da enterovirus e in ordine inverso che può portare a. Quindi, finora, sappiamo che ci sono centinaia e migliaia o più infezioni da enterovirus rispetto ai casi di AFM. Ma sapendo che è molto importante conoscere caso e controllo.

[00:37:43] Quindi, adottiamo un approccio imparziale. Stiamo dividendo la proteina virale in una parte molto, molto piccola. Sono 12 amminoacidi. Quindi, riduci la reattività incrociata e il rilevamento degli anticorpi. E se rileviamo qualcosa nei casi AFM o non rileviamo i casi di controllo o viceversa, vogliamo vedere dopo un mese o due mesi, se quegli anticorpi rimangono ancora nel paziente, o si stanno esaurendo in quel paziente, o aumentando nel paziente e quali sono i loro ruoli – aumento, diminuzione o scomparsa nell'esito del paziente. Quindi, se facciamo questo tipo di studio, tipo, più meno, dovremo identificare le risposte e quindi possiamo prendere l'iniziativa e passare anche alla terapia e alla diagnosi precoce.

Dott. Carlos Pardo: [00:38:32] Grazie, Nischay. Eileen, uno dei problemi frequenti che abbiamo in ambito clinico è che molti pazienti, quando arrivano negli ospedali terziari, negli ospedali universitari, sono già stati trattati con steroidi, o anche immunoglobuline EV, IV o IVIG, o anche plasmaferesi . Cosa dovrebbero fare i medici con quei campioni? Sono in grado di condividere quei campioni con il repository CDC?

Dott.ssa Eileen Yee: [00:39:03] Sì, lo sono. Tanto più che alcuni bambini sono stati visti in regime ambulatoriale dove hanno ricevuto un antibiotico o uno steroide. Vorremmo comunque che inviassero un campione. Ed è anche la tempestività del campione è davvero importante, in termini di successo nella ricerca di un agente patogeno. Quindi, vorremmo ancora raccoglierli e, a un certo punto, essere in grado di raccogliere qualche informazione in più su di loro.

Dott. Carlos Pardo: [00:39:30] Grazie, Eileen. Amy, una delle domande che le famiglie ci fanno spesso in ambito clinico, è un nuovo virus o è un virus che è mutato perché i virus circolano da secoli? Quindi, è un nuovo virus o è qualcosa che è mutato da e dal 2012, per esempio?

Dott.ssa Amy Rosenfeld: [00:39:51] Quindi, non è un nuovo virus. Non è mutato. Si tratta di un virus inizialmente isolato nel 1962, ma ciò non significa che non fosse presente prima. Questo è solo quando è stato isolato. E, abbiamo dimostrato, il mio lavoro ha dimostrato che il virus è sempre stato in grado di causare o replicarsi all'interno delle cellule all'interno del sistema nervoso.

[00:40:17] Quindi, non è una nuova proprietà del virus. Ciò che ipotizziamo è in realtà il fatto che esista una linea di base di AFM. E la maggior parte dei bambini, la maggior parte dei casi di AFM, fino alla somministrazione del vaccino antipolio, erano associati all'infezione da virus della polio perché si tratta di un'infezione più, come si dice, pervasiva. Quindi, ci sono più casi di poliomielite. È chiaramente un virus più robusto dell'EV-D68 e probabilmente più facilmente trasmesso perché è attraverso la via fecale orale e roba del genere. Ma con la riduzione della trasmissione della poliomielite, con i due vaccini molto efficaci, un vaccino antipolio orale e IPV, ci ha aperto a vedere cose che causano AFM con frequenza ridotta.

[00:41:20] E quindi questa è la nostra ipotesi. E che in realtà, probabilmente, la somministrazione o l'immunizzazione di bambini con diverse forme di vaccino antipolio potrebbe anche compromettere la nostra capacità di rilevare l'EV-D68, poiché abbiamo, crediamo di avere anticorpi che possono essere indotti dal il vaccino antipolio si lega a EV-D68 e impedisce a EV-D68 di diffondersi in siti di organi secondari, che è ciò che è il sistema nervoso centrale.

[00:41:53] E con il cambio di OPV in IPV, quel processo potrebbe essere stato interrotto. E quindi, non è un nuovo virus. Non sta alterando. È qualcosa che era molto più basso, con un tasso di un paziente su centomila che ha sviluppato AFM a causa dell'infezione da EV-D68, rispetto alla poliomielite, che è più alla pari di un'infezione su mille.

[00:42:19] Quindi, puoi vedere quando sei dieci volte, cento log, due log off, perché quando prendi una grande popolazione, potresti non rilevare EV-D68 o associare automaticamente l'infezione EV-D68 con il sviluppo della paralisi.

Dott. Carlos Pardo: [00:42:36] Grazie, Amy. Questa è una domanda per Janell. Janell, in passato, devo confessare che a volte avevo paura di inviare campioni al CDC per la diagnosi, ma ho imparato negli ultimi anni lo spirito di collaborazione e condivisione di campioni che il CDC come istituzione sta iniziando a sviluppare con i ricercatori. In che modo quei campioni che stiamo inviando al CDC verranno condivisi con Nischay, Amy o altri laboratori? Ti dispiacerebbe approfondire l'argomento?

Dott.ssa Janell Routh: [00:43:11] Certo, Carlos. SÌ. Quindi, tutti i campioni inviati al CDC dai medici attraverso il Dipartimento della Salute dello Stato arrivano nel nostro laboratorio. Noi, Carlos, come hai detto, conduciamo studi diagnostici per entero, rhinovirus e poi, se questi sono positivi, andiamo avanti con la tipizzazione di quegli enterovirus per determinare quali tipi sono presenti nei campioni dei nostri pazienti con AFM o sospetta AFM.

[00:43:41] I campioni vengono quindi conservati nel nostro laboratorio e sono disponibili. Abbiamo avuto due grandi collaborazioni, una con il laboratorio di Nischay e poi un'altra all'Università della California a San Francisco per fornire campioni, inclusi campioni di CSF, che sono in qualche modo i più preziosi tra i campioni che ci arrivano per essere utilizzati nel loro saggi. E sono felice di discutere ulteriori collaborazioni con quegli esemplari che vanno avanti.

[00:44:16] Quindi, si tratta di mettersi in contatto con noi qui al CDC e discutere di questa collaborazione. Come ha detto il dottor Yee, stiamo andando avanti con l'AFM Biorepository che raccoglierà ulteriori campioni da conservare. E quegli esemplari saranno quindi combinati con il Biorepository NIH in un biorepository comune che sarà disponibile per i ricercatori che vanno avanti.

Dott. Carlos Pardo: [00:44:47] Grazie, Janell. E c'è una domanda da parte del pubblico su cosa stiamo imparando sulla prognosi per i bambini a cui viene diagnosticata l'AFM e se c'è speranza di miglioramento a 2, 5, 10 anni dalla diagnosi? E in realtà, prenderò l'iniziativa per rispondere a questa domanda. La nostra esperienza è che ci sono ottime prove che il tasso di recupero è molto migliore nei bambini quando soffrono di mielite rispetto agli adulti.

[00:45:22] C'è una cosa nei bambini chiamata plasticità sinaptica e plasticità neurologica che consente ai bambini di avere un recupero migliore dopo una lesione del sistema nervoso centrale, sia nel cervello che nel midollo spinale. E AFM ne è un altro esempio. Abbiamo osservato negli ultimi anni, nei nostri centri di riabilitazione, che molti bambini affetti da AFM sono rimasti con disabilità significative.

[00:45:50] Ma ciò non significa che non ci sia speranza di guarigione. E recentemente abbiamo appreso da uno dei nostri pazienti, ad esempio, che era dipendente dal ventilatore, che, dopo quasi due anni, per essere dipendente dal ventilatore con l'intervento, la riabilitazione e lo sforzo, in realtà questo paziente sta avendo una migliore capacità di respirare da solo.

[00:46:12] Quindi, è estremamente importante capire che il processo di riabilitazione non è solo l'intervento medico, ma è anche l'intervento del team di riabilitazione e del fisioterapista, terapista occupazionale e l'intero team che sta partecipando il recupero di questi pazienti. Quindi, questa è una domanda molto importante perché c'è sempre speranza se c'è resilienza e ci sono sforzi per migliorare tutti i nostri pazienti con AFM, avremo risultati molto migliori in futuro.

[00:46:43] Vorrei chiedere ai nostri quattro partecipanti, solo brevemente, qual è il vostro desiderio e il vostro messaggio principale per il nostro pubblico, i genitori, in particolare, e i membri della famiglia sulla ricerca sull'AFM? Amy, fammi iniziare con te. Qual è il tuo messaggio principale?

Dott.ssa Amy Rosenfeld: [00:47:06] Il mio messaggio principale è che la scienza di base ci porterà fuori da questo. Si tratta di capire come funziona il corpo, come il virus interagisce con il corpo e non si dovrebbe mai sottovalutare la scienza di base, perché questo ci dirà cosa dobbiamo fare.

[00:47:28] E rivelerà interazioni che non conoscevamo o che avevamo sottovalutato. Quindi, come viene innervato il sistema respiratorio e come ciò può portare alla malattia dei motoneuroni, dove gli arti superiori sono compromessi, e come il sistema immunitario risponde a ciò e interagisce con la diffusione o l'intervento del virus.

[00:47:53] E così è, la ricerca è difficile. Incontrerai molti fallimenti, ma non puoi arrenderti. E quindi, non mi arrendo, quindi non dovrebbero rinunciare alla scienza di base perché è quello che, quegli esperimenti rischiosi ci porteranno fuori da questo.

Dott. Carlos Pardo: [00:48:13] Quindi, Amy ci sta dicendo che anche gli scienziati hanno resilienza. Grazie. E Nischay, qual è il tuo messaggio principale?

Dott. Nischay Mishra: [00:48:22] Il mio primo messaggio principale è, tipo, sono felice e penso che siamo stati fortunati a non aver visto alcun caso di AFM negli ultimi due anni, e spero che continui, tipo, in quel modo. Ma anche quel caso, se è successo qualcosa allora, tipo, tutti gli sforzi, tipo, tutti i genitori e tutori che ci stanno ascoltando, se si sentono, e vengono a conoscenza di casi del genere, sia dalla comunità che da chiunque altrimenti, dovrebbero diffondere il messaggio.

[00:48:48] Le persone dovrebbero contattare noi o il dottor Pardo in qualche altro modo in modo che possiamo rilevare correttamente il problema. E come ha detto Amy, sì, certo, la scienza di base è sempre stata la spina dorsale del fare le cose e usando questi, come, nuovi metodi moderni, dati ad alto rendimento e apprendimento automatico, abbiamo fatto cose che non erano possibili forse cinque , dieci anni fa.

[00:49:11] Abbiamo visto l'anno scorso quanto velocemente potremmo portare alla diagnostica e, ad esempio, alla terapia, nonché al vaccino per COVID-19. E penso che sia un modello per noi, per altre malattie emergenti e malattie infettive, solo che possiamo lavorare insieme, medici, genitori, scienziati, produttori, biotecnologia e gruppo farmaceutico. Possiamo risolvere qualsiasi problema se lavoriamo insieme e lo esaminiamo in modo tempestivo.

Dott. Carlos Pardo: [00:49:41] Grazie, Nischay. Eileen, qual è il tuo messaggio principale?

Dott.ssa Eileen Yee: [00:49:44] Certo. Vorrei solo accettare, in termini di, per i genitori e i medici, di riconoscere l'AFM. E una volta fatto per favore ricoverare in ospedale e denunciare. E, poiché è raro, questo è il motivo per cui questi biorepository sono così inestimabili e incoraggiamo tutti a partecipare, se possibile.

Dott. Carlos Pardo: [00:50:08] Grazie, Eileen. Janell, qual è il tuo messaggio principale e finale per il pubblico?

Dott.ssa Janell Routh: [00:50:14] Grazie, Carlos. Sento che riecheggia molto di ciò che Nischay e Amy hanno appena menzionato. Oggi guardo intorno a questo pannello e vedo la rappresentazione della scienza di base, da te come medico, da me e Eileen qui al CDC. E mi ricorda che le risposte a questa malattia molto complessa verranno da tutti noi, che ci vorrà davvero ognuno di noi a svolgere il proprio ruolo per trovare le risposte ad alcune delle domande sconcertanti che sono ancora là fuori su AFM.

[00:50:50] E mi fa capire quanto lontano siamo arrivati ​​dal 2018, la nostra ultima grande ondata di casi di AFM. Sento che ci siamo davvero riuniti come comunità, inclusi SRNA e i genitori, per formare davvero una comunità unita che sta lavorando su tutti gli aspetti dell'AFM, aumentando la consapevolezza, come ha detto Eileen, e poi certamente la ricerca scientifica di base che Amy e Nischay stanno dirigendo. Non vedo davvero l'ora di vedere cosa possiamo scoprire nei prossimi due anni, perché sicuramente abbiamo fatto molta strada.

Dott. Carlos Pardo: [00:51:25] Grazie, Janell. E il mio messaggio finale per tutti voi è che l'unico modo per raggiungere una comprensione molto profonda dell'AFM è lo spirito di collaborazione. Non siamo in grado di affrontare l'AFM se non abbiamo una buona collaborazione con le famiglie, con i pazienti, con gli operatori sanitari, gli scienziati che partecipano alla ricerca, alla ricerca scientifica di base in laboratorio e agli epidemiologi che stanno cercando per i fattori di rischio ad essi associati, i clinici che si prendono cura del paziente, i terapisti. Quindi, questo è uno sforzo di squadra.

[00:52:01] Quindi, il messaggio principale è che dobbiamo continuare a lavorare insieme con l'aiuto dell'SRNA, abbiamo un buon gruppo, l'Associazione per la mielite flaccida acuta, i genitori che fanno parte dell'Associazione per la mielite flaccida acuta, gli scienziati che fanno parte dell'Acute Flaccid Myelitis Working Group e molte altre persone stanno lavorando insieme solo cercando di capire l'AFM.

[00:52:25] Quindi, il messaggio principale è continuare a lavorare insieme e partecipare a questo importante sforzo per aiutare i nostri pazienti e le loro famiglie. Grazie mille per essere disponibile questa mattina e grazie, Roberta, per averci permesso di discutere di questo importante tema.

Roberta Pesce: [00:52:40] Beh, sì. Grazie mille a tutti. Apprezziamo molto il tuo tempo. È bello vedere così tanti esperti riunirsi e discutere di un argomento così importante. Quindi, grazie mille a tutti.